눈에 보이지 않는 Biological Process를
어떻게 추적할 수 있을까요?

DNA synthesis, 새롭게 합성되는 protein, glycosylation과 같은 dynamic biological process는 일반적인 endpoint assay만으로는 언제 어디에서 발생했는지 직접 추적하기 어렵습니다. Metabolic labeling과 bioorthogonal click chemistry를 이용하면 세포가 진행 중인 biological activity에 chemical handle을 남긴 뒤 이를 fluorescence, biotin 또는 affinity tag로 검출할 수 있습니다.

Labeling 실험은 Dye 선택에서 시작하지 않습니다

Fluorescent labeling 실험을 준비할 때 흔히 “어떤 fluorophore를 사용할까?”부터 고민합니다.

하지만 실제로는 먼저 무엇을 추적하려는가를 결정해야 합니다.

새롭게 합성되는 DNA인지, nascent protein인지, glycan인지, 이미 정제된 antibody인지에 따라 적합한 labeling chemistry가 완전히 달라집니다.

① DNA/RNA Synthesis를 추적한다면

새롭게 합성되는 nucleic acid를 연구할 때는 modified nucleoside를 metabolic precursor로 사용할 수 있습니다.

대표적인 예가 EdU입니다. EdU는 thymidine analog로 DNA synthesis 과정에서 새 DNA에 incorporation됩니다.

EdU에 포함된 alkyne group은 이후 azide-functionalized fluorophore 또는 biotin과 click reaction을 통해 선택적으로 검출할 수 있습니다.

따라서 DNA replication, cell proliferation 및 cell-cycle 관련 연구에서 새롭게 합성된 DNA population을 visualization하거나 정량할 수 있습니다.

② 새롭게 만들어지는 Protein을 추적한다면

세포 안에 이미 존재하는 전체 protein을 측정하는 것과 지금 새롭게 합성되고 있는 protein을 측정하는 것은 다른 질문입니다.

AHA 또는 HPG와 같은 methionine analog를 사용하면 protein translation 과정에서 newly synthesized protein에 azide 또는 alkyne chemical handle을 도입할 수 있습니다.

이후 complementary click reagent를 사용하면 nascent protein synthesis를 fluorescence 또는 affinity-based 방식으로 검출할 수 있습니다.

③ Glycosylation을 추적한다면

Glycosylation은 protein trafficking, cell-cell interaction, immune recognition 및 cancer biology 등 다양한 biological process와 연결됩니다.

Azido 또는 alkynyl sugar analog를 cell에 공급하면 cellular glycan biosynthesis pathway를 통해 새롭게 만들어지는 glycan에 bioorthogonal chemical handle을 도입할 수 있습니다.

이후 click chemistry를 이용해 glycan을 fluorescence imaging하거나 biotin 기반으로 enrichment할 수 있습니다.

왜 Click Chemistry를 사용할까요?

Cell 안에는 매우 다양한 functional group이 존재합니다. 따라서 labeling reaction은 native biological chemistry를 방해하지 않으면서 원하는 chemical handle에만 선택적으로 반응해야 합니다.

Azide와 alkyne 기반 click chemistry가 널리 사용되는 이유가 여기에 있습니다.

예를 들어 azide가 도입된 biomolecule은 alkyne fluorophore 또는 alkyne-biotin과 선택적으로 연결할 수 있습니다. 반대로 alkyne이 도입된 biomolecule에는 azide probe를 사용할 수 있습니다.

Copper Click vs. Copper-Free Click

CuAAC
Azide와 terminal alkyne 사이의 copper-catalyzed reaction으로 빠르고 효율적인 conjugation이 가능합니다.

SPAAC
DBCO와 같은 strained cyclooctyne을 사용하면 copper catalyst 없이 azide와 반응시킬 수 있습니다.

Live-cell labeling이나 copper-sensitive biological system에서는 copper-free chemistry가 더 적합할 수 있으므로 sample type과 downstream application을 고려해야 합니다.

Fluorescence가 항상 정답은 아닙니다

정제된 Antibody나 Protein을 직접 Labeling한다면?

Metabolic labeling과 달리 이미 정제된 antibody 또는 protein에는 lysine의 amine이나 cysteine의 thiol과 같은 functional group을 이용해 fluorophore 또는 biotin을 직접 conjugation할 수 있습니다.

Vector Laboratories의 ChromaLINK® technology는 lysine-containing protein에 biotin을 도입하면서 UV-traceable chromophore를 함께 포함합니다.

따라서 labeling 후 단순히 “biotinylation이 됐다”는 것뿐 아니라 protein molecule당 도입된 biotin의 정도를 UV measurement로 직접 정량할 수 있습니다.

ChromaLINK Protein Labeling Kit는 20–200 kDa protein을 대상으로 reaction당 약 25 µg부터 1 mg까지 적용할 수 있습니다.

Labeling Strategy Checklist

✓ 무엇을 추적하려는가 — DNA, RNA, protein, glycan?

✓ 기존 molecule인가, newly synthesized molecule인가?

✓ Live cell에서 labeling해야 하는가?

✓ Fluorescence imaging이 필요한가?

✓ Flow cytometry 분석이 필요한가?

✓ Affinity purification까지 진행할 것인가?

✓ Copper catalyst 사용이 가능한가?

✓ Multiplex라면 다른 fluorophore와 spectral overlap은 없는가?

✓ Labeling이 biomolecule의 기능을 방해하지 않는가?

어떤 Labeling Reagent를 선택해야 할지 고민하고 계신가요?

알앤디메이트에서는 metabolic labeling, click chemistry, fluorescent dye, biotinylation 및 biomolecule conjugation 연구에 필요한 reagent와 kit를 함께 검토합니다.

Labeling할 molecule, sample type, 원하는 detection method와 downstream application을 알려주시면 적합한 chemistry와 제품을 검토해 드립니다.