Cardiac Troponin I를 검출할 때
Epitope 위치만 보면 충분할까요?
Cardiac Troponin I(cTnI)는 심근 손상 평가에 중요한 biomarker입니다. 하지만 실제 환자의 혈액에서 cTnI는 하나의 일정한 molecular form으로만 존재하지 않습니다. ITC complex, IC complex 및 다양한 proteolytic fragment가 함께 존재할 수 있기 때문에 immunoassay 개발에서는 antibody가 어디에 결합하는지만큼 어떤 molecular context에서 target을 인식하는가도 중요합니다.
혈액 속 cTnI는 하나의 분자가 아닙니다
심근세포가 손상되면 cardiac troponin이 혈액으로 방출됩니다. 하지만 circulation으로 나온 troponin은 시간이 지나면서 동일한 구조를 유지하지 않습니다.
HyTest 연구진의 환자 sample 연구에 따르면 circulating cardiac troponin은 여러 molecular form의 혼합물로 존재할 수 있습니다.
ITC complex
cTnI + cTnT + TnC
↓ fragmentation / degradation ↓
IC complex
cTnI + TnC
+
Partially fragmented troponin forms
더 중요한 것은 이러한 molecular form의 상대적인 비율도 심근경색 이후 시간에 따라 달라질 수 있다는 점입니다.
그래서 Epitope Selection이 중요합니다
Sandwich immunoassay를 개발할 때 일반적으로 capture antibody와 detection antibody가 cTnI의 어느 amino-acid region을 인식하는지를 확인합니다.
하지만 환자 sample에서 cTnI가 degradation되거나 다른 troponin component와 complex를 형성하면 원래 antibody가 인식하던 epitope가 사라지거나 가려질 수 있습니다.
따라서 좋은 antibody pair는 단순히 affinity가 높은 것만으로는 충분하지 않고 실제 circulation에서 존재하는 다양한 cTnI molecular form을 얼마나 안정적으로 인식하는가를 함께 평가해야 합니다.
Linear Epitope를 넘어 Complex-Dependent Recognition으로
여기서 흥미로운 접근이 complex-dependent antibody recognition입니다.
일반적인 cTnI antibody는 cTnI sequence상의 특정 amino-acid region을 인식합니다.
반면 complex-dependent antibody는 단순한 linear sequence뿐 아니라 cTnI가 troponin complex 안에 존재할 때 형성되는 structural context를 이용해 target을 인식합니다.
즉 antibody selection의 질문이 달라집니다.
“이 antibody는 cTnI의 어느 amino-acid region을 인식하는가?”
추가해야 할 질문
“이 antibody는 circulating cTnI가 어떤 molecular form일 때 인식할 수 있는가?”
cTnI의 Central Region이 중요한 이유
HyTest가 정리한 연구에 따르면 cTnI의 central region은 terminal region에 비해 proteolytic degradation에 상대적으로 안정적인 영역입니다.
이 때문에 현재 많은 diagnostic assay가 cTnI의 central region을 인식하는 antibody를 사용합니다.
하지만 여기에도 한 가지 문제가 있습니다.
cTnI가 TnC와 complex를 형성하면 일부 central-region epitope는 TnC에 의해 가려질 수 있습니다.
따라서 단순히 “central epitope = 좋은 antibody”라고 판단하기보다 complex formation까지 포함한 실제 sample 상태에서 antibody recognition을 평가하는 것이 중요합니다.
Assay 결과에 영향을 줄 수 있는 요소
| Factor | Assay에 미칠 수 있는 영향 |
|---|---|
| Proteolytic degradation | Antibody epitope가 소실될 수 있음 |
| Complex formation | TnC/TnT에 의해 특정 epitope가 가려질 수 있음 |
| Phosphorylation / PTM | Antibody recognition이 달라질 가능성 |
| Autoantibody | Target epitope 접근성을 방해할 수 있음 |
| Sample timing | MI 이후 시간에 따라 circulating form의 비율이 변할 수 있음 |
HyTest의 Complex-Dependent cTn Antibody
HyTest는 circulating troponin complex의 structural context를 인식하는 anti-cTn complex antibody를 개발해 왔습니다.
현재 공개된 제품에는 다음 항체가 포함됩니다.
Cat. #4TC2 — MAb 20C6cc
Cat. #RC4TC2 — MAb RecChim20C6
HyTest는 이 항체들을 defined cTnI epitope를 인식하는 antibody들과 조합하여 assay development에 평가하고 있습니다.
추천 antibody architecture에는 1+1, 2+1 및 2+2 format이 포함되며, CLIA와 lateral-flow assay뿐 아니라 high-sensitivity cTnI assay 개발을 위한 starting point로도 제시됩니다.
cTnI Assay를 개발한다면 확인할 항목
✓ Capture / detection antibody의 epitope
✓ Free cTnI와 complexed cTnI recognition
✓ IC / ITC complex에 대한 반응
✓ Proteolytic fragment recognition
✓ Autoantibody interference
✓ Antibody affinity
✓ Calibrator molecular form
✓ CLIA / lateral flow 등 assay platform
✓ 목표 sensitivity와 clinical sample performance
Cardiac Biomarker Assay를 개발하고 계신가요?
알앤디메이트에서는 cardiac troponin을 포함한 IVD 및 biomarker assay 개발에 필요한
monoclonal antibody, recombinant/native antigen, calibrator 및 serum/plasma material을
검토합니다.
Target biomarker, assay platform(CLIA/LF/ELISA 등),
필요한 antibody pair와 개발 단계를 알려주시면
HyTest 제품을 포함하여 적합한 원료의 견적 및 공급 가능 여부를 확인해 드립니다.