CRISPR Screen에서 Hit을 찾았다면,
그 세포에서는 실제로 무엇이 바뀌었을까요?

CRISPR screening은 어떤 gene이 phenotype에 영향을 주는지 찾는 강력한 방법입니다. 하지만 guide RNA sequencing만으로는 그 perturbation이 protein expression, cell morphology와 전체 transcriptome을 어떻게 변화시켰는지 충분히 설명하기 어렵습니다. Single-cell multimodal screening은 이러한 정보를 같은 cell에서 연결합니다.

CRISPR Screen의 다음 질문

전통적인 pooled CRISPR screen에서는 특정 phenotype이 나타난 population을 찾고 어떤 guide RNA가 enrichment 또는 depletion되었는지를 분석합니다.

이를 통해 중요한 gene candidate를 발견할 수 있지만 다음 질문이 남습니다.

그 gene을 knockout했을 때 cell morphology는 어떻게 변했을까요?

Downstream protein expression은 어떻게 달라졌을까요?

어떤 signaling pathway가 활성화되거나 억제되었을까요?

Transcriptome 전체에는 어떤 변화가 발생했을까요?

이러한 질문에 답하려면 perturbation identity와 phenotype을 동일한 single cell 수준에서 연결하는 것이 중요합니다.

한 Cell에서 4개의 Biological Layer를 읽기

① Guide RNA
어떤 CRISPR perturbation이 해당 cell에 들어갔는지 확인합니다.

② Morphology
Nucleus, membrane, actin, mitochondria 등 cellular structure의 변화를 관찰합니다.

③ Protein
Target protein의 abundance, localization 또는 signaling activation을 분석합니다.

④ 3′ Transcriptome
Targeted gene panel에 제한되지 않고 perturbation에 따른 genome-wide transcriptional response를 분석합니다.

왜 같은 Cell에서 측정하는 것이 중요할까요?

각 modality를 서로 다른 sample에서 측정하면 population 평균을 비교하게 됩니다.

반면 같은 cell에서 guide RNA, morphology, protein과 RNA를 측정하면 원인과 결과를 cell 단위로 직접 연결할 수 있습니다.

실제 Multimodal CRISPR Dataset에서는?

Element Biosciences가 공개한 Cytos™ Multimodal Pooled Screening dataset에서는 guide sequencing, 3′ transcriptome, Cell Paint와 4-plex protein detection을 같은 workflow에서 수행했습니다.

Baseline 및 TNF-α stimulation 조건에서 총 258,277 cells를 profiling했으며, 87%의 cells에 guide RNA가 assignment되었습니다.

TGFBR2 knockout cell에서는 TGFBR2 transcript 자체뿐 아니라 PMEPA1, TGFBI, CDH2, IGFBP7, S100A4 등 canonical TGF-β downstream target 감소와 matching morphological phenotype이 관찰되었습니다.

Protein Readout이 중요한 이유

RNA abundance가 항상 protein abundance 또는 pathway activity와 일치하는 것은 아닙니다.

특히 phosphorylation, protein localization, receptor abundance와 같은 정보는 transcriptome만으로 직접 측정할 수 없습니다.

Cytos™에서는 immunofluorescence 기반으로 최대 20-plex protein readout을 사용할 수 있으며, custom target을 추가할 때 별도의 antibody barcoding이나 conjugation이 필요하지 않습니다.

이 과정에서 검증된 high-quality antibody 선택은 protein phenotype의 신뢰도를 결정하는 중요한 요소가 됩니다.

ABclonal × Element Biosciences

ABclonal과 Element Biosciences는 spatial 및 single-cell protein profiling을 위해 antibody reagent와 AVITI24™ multiomic workflow를 연결하고 있습니다.

ABclonal은 biotinylated antibody를 포함한 다양한 validated antibody portfolio를 제공하며, 이를 통해 cell-surface, intracellular 및 signaling protein을 연구할 수 있습니다.

중요한 것은 antibody 자체가 아니라 genetic perturbation → RNA response → protein phenotype → morphology를 하나의 biological story로 연결할 수 있다는 점입니다.

Drug Screening에도 같은 접근을 사용할 수 있습니다

이 workflow는 CRISPR에만 국한되지 않습니다.

Drug-treated cell에서 morphology, protein과 transcriptome을 동시에 분석하면 단순 viability endpoint보다 훨씬 많은 정보를 얻을 수 있습니다.

예를 들어 후보물질별로 다음을 동시에 비교할 수 있습니다.

✓ Dose-dependent morphology change

✓ Target / pathway protein 변화

✓ Transcriptome-wide response

✓ Responder / non-responder cell population

✓ Potential mechanism of action

Single-Cell Multimodal Screening을 검토할 만한 연구

✓ Genome-wide / focused CRISPR screen

✓ Optical pooled screening

✓ Functional genomics

✓ Drug mechanism-of-action study

✓ Phenotypic drug screening

✓ Signaling pathway analysis

✓ Protein localization 연구

✓ Cell morphology profiling

✓ Perturbation → phenotype 연결 연구

CRISPR, Spatial Proteomics 또는 Single-Cell Multiomics 연구를 준비하고 계신가요?

알앤디메이트에서는 CRISPR screening, spatial/single-cell protein profiling, validated antibody 및 multiomics 연구에 필요한 제품과 workflow를 함께 검토합니다.

Target, sample type, 필요한 protein marker, CRISPR library와 원하는 biological readout을 알려주시면 적합한 antibody와 연구 workflow를 검토해 드립니다.