CUT&RUN / CUT&Tag에서
Control Antibody가 중요한 이유

좋은 sequencing library를 만드는 것만으로는 충분하지 않습니다. 실제 signal과 background를 구분할 수 있어야 합니다. CUT&RUN과 CUT&Tag에서는 primary antibody뿐 아니라 IgG negative control과 secondary antibody의 선택도 결과의 해석과 peak calling에 직접적인 영향을 줄 수 있습니다.

CUT&RUN과 CUT&Tag는 무엇이 다를까요?

두 방법 모두 특정 chromatin-associated protein이나 histone modification이 genome의 어느 위치에 존재하는지를 분석하기 위한 epigenomics 기술입니다.

전통적인 ChIP 기반 분석과 달리 target antibody가 결합한 위치 주변에서 DNA를 직접 절단하거나 tagmentation하여 sequencing library를 생성합니다.

CUT&RUN에서는 antibody-target complex 주변으로 protein A/G-MNase를 모집하여 인접 DNA를 절단합니다.

CUT&Tag에서는 protein A-Tn5 또는 pA/G-Tn5가 antibody가 결합한 chromatin 위치에 sequencing adapter를 삽입합니다.

문제는 Background입니다

Sequencing 결과에 peak가 보인다고 해서 모든 peak가 biological target을 의미하는 것은 아닙니다.

비특이적 antibody binding, secondary antibody interaction, enzyme recruitment 및 chromatin accessibility 등에 의해 background signal이 발생할 수 있습니다.

따라서 CUT&RUN/CUT&Tag에서는 실제 target signal과 background를 구분할 수 있는 적절한 negative control이 중요합니다.

CUT&RUN에서 IgG Negative Control의 역할

Experimental antibody 대신 동일한 host species의 non-specific IgG를 사용하면 antibody 및 assay 자체에서 발생하는 background를 평가할 수 있습니다.

좋은 negative control은 target-specific peak를 만들지 않아야 하며, experimental sample과 비교했을 때 명확한 background separation을 보여야 합니다.

이 background profile은 이후 peak calling 과정에서 어떤 signal을 실제 enrichment로 판단할 것인지 결정하는 중요한 기준이 됩니다.

CUT&Tag에서는 Secondary Antibody도 중요합니다

CUT&Tag에서는 rabbit primary antibody와 같은 primary antibody에 secondary antibody를 추가하여 protein A-Tn5가 결합할 수 있는 interaction site를 증가시키는 workflow를 사용할 수 있습니다.

따라서 secondary antibody의 specificity가 낮으면 원하는 target 이외의 위치에도 Tn5 recruitment가 증가해 background가 높아질 가능성이 있습니다.

특히 low-input CUT&Tag에서는 signal-to-background ratio가 중요하기 때문에 검증된 secondary antibody를 사용하는 것이 중요합니다.

Guinea Pig anti-Rabbit IgG — ABIN101961

antibodies-online의 ABIN101961은 preadsorbed Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) polyclonal antibody입니다.

하나의 antibody가 서로 다른 두 chromatin profiling workflow에서 독립적으로 검증된 것이 특징입니다.

왜 Preadsorbed Antibody를 사용할까요?

Secondary antibody가 sample에 존재하는 다른 species의 immunoglobulin이나 serum protein과 cross-react하면 background가 증가할 수 있습니다.

ABIN101961은 solid-phase preadsorption을 거친 제품으로, 제조사 시험에서 human, mouse 및 goat serum protein에 대한 반응이 관찰되지 않았습니다.

이러한 cross-reactivity control은 복잡한 biological sample을 사용하는 epigenomics workflow에서 background를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.

CUT&RUN / CUT&Tag 실험 체크리스트

✓ Primary antibody가 해당 application에서 검증되었는가?

✓ 적절한 IgG negative control을 포함했는가?

✓ Primary antibody host와 secondary antibody가 맞는가?

✓ Secondary antibody의 cross-reactivity를 확인했는가?

✓ Positive histone control을 포함했는가?

✓ Negative control library의 background가 충분히 낮은가?

✓ Peak calling에서 control dataset을 적절히 사용했는가?

CUT&RUN 또는 CUT&Tag 실험을 준비하고 계신가요?

알앤디메이트에서는 CUT&RUN/CUT&Tag용 primary antibody, IgG control, secondary antibody, magnetic beads 및 chromatin profiling 관련 reagent를 함께 검토합니다.

Target protein 또는 histone mark, sample species, primary antibody host와 사용 중인 workflow를 알려주시면 필요한 reagent 구성을 검토해 드립니다.