Kinase Inhibitor가 Target에 결합하면
실제 세포에서도 작동하는 걸까요?

신약 후보물질의 potency를 평가할 때 하나의 IC50 값만으로는 compound의 작용을 충분히 설명하기 어렵습니다. Biochemical activity, intracellular target engagement, cellular signaling을 서로 다른 관점에서 확인하는 orthogonal assay 전략이 필요한 이유입니다.

같은 IC50라도 의미가 다를 수 있습니다

Purified kinase를 이용한 biochemical assay에서 강한 inhibition을 보인 compound가 반드시 세포 안에서도 동일한 potency를 보이는 것은 아닙니다.

실제 세포에서는 membrane permeability, intracellular ATP concentration, protein expression, competing pathways 등 다양한 요소가 compound activity에 영향을 줍니다.

따라서 kinase drug discovery에서는 하나의 assay 결과보다 서로 다른 원리를 사용하는 여러 assay를 연결해 해석하는 것이 중요합니다.

① Biochemical Kinase Activity

가장 먼저 확인할 질문은 단순합니다.

“이 compound가 kinase catalytic activity를 억제하는가?”

Purified enzyme 기반 kinase assay는 compound의 기본적인 potency와 kinase selectivity를 빠르게 비교하는 데 유용합니다.

Reaction Biology의 biochemical kinase screening portfolio는 870개 이상의 kinase assay와 260개 이상의 clinically relevant mutant를 포함하며, broad kinome selectivity 및 resistance mutant profiling에 활용할 수 있습니다.

② NanoBRET Intracellular Target Engagement

다음 질문은 한 단계 더 현실적입니다.

“Compound가 살아 있는 세포 안으로 들어가 실제 target에 결합하는가?”

NanoBRET target engagement assay에서는 kinase target을 NanoLuc luciferase와 fusion하여 세포 안에서 발현하고, fluorescent tracer와 compound 사이의 competitive displacement를 이용해 intracellular target engagement를 측정합니다.

따라서 biochemical assay에서는 확인하기 어려운 cell permeability와 physiological intracellular environment를 반영할 수 있습니다.

③ Cellular Phosphorylation

Target에 결합했다면 마지막으로 확인해야 할 질문이 있습니다.

“그 결합이 실제 kinase signaling 억제로 이어지는가?”

Cellular phosphorylation assay는 살아 있는 세포에서 kinase 또는 downstream substrate의 phosphorylation 변화를 측정합니다.

즉 NanoBRET이 binding을 확인한다면, cellular phosphorylation assay는 그 결합의 functional consequence를 확인하는 역할을 합니다.

세 가지 결과를 함께 보면 무엇을 알 수 있을까요?

Mutant Panel이 중요한 이유

Oncology drug development에서는 wild-type kinase에 대한 potency만으로 충분하지 않은 경우가 많습니다.

치료 과정에서 발생하거나 이미 존재하는 resistance mutation이 compound binding과 activity를 크게 변화시킬 수 있기 때문입니다.

NanoBRET 기반 mutant panel에서는 ABL1, FLT3, KIT, MET, PIK3CA 등 여러 clinically relevant variant를 wild type과 동일한 cellular background에서 비교할 수 있습니다.

이를 통해 potency shift가 mutation 자체에서 비롯된 것인지 보다 명확하게 평가할 수 있습니다.

Kinase Drug Discovery 체크리스트

✓ Biochemical potency를 확인했는가?

✓ Kinome selectivity를 평가했는가?

✓ 살아 있는 세포에서 target engagement를 확인했는가?

✓ Cellular phosphorylation까지 억제되는가?

✓ Wild-type과 resistance mutant를 비교했는가?

✓ Intracellular affinity와 biochemical IC50 사이에 차이가 있는가?

✓ Functional cellular assay까지 연결할 필요가 있는가?

Kinase Screening 또는 Drug Discovery 프로젝트를 준비하고 계신가요?

알앤디메이트에서는 biochemical kinase screening, mutant profiling, NanoBRET intracellular target engagement, cellular phosphorylation 등 신약개발 연구에 필요한 assay 및 CRO 서비스를 함께 검토합니다.

Target, compound 수, 필요한 assay 단계와 개발 목적을 알려주시면 적합한 분석 방법과 서비스 옵션을 찾아드립니다.