Multiplex IF에서 Background를 줄이는 방법
Chicken IgY Antibody가 유용한 이유

여러 target을 동시에 관찰하는 multiplex immunofluorescence에서는 항체의 specificity뿐 아니라 primary antibody의 host species 선택이 실험의 signal-to-background ratio를 좌우할 수 있습니다.

Multiplex IF가 복잡해질수록 Background도 증가합니다

Mouse, rabbit 등 여러 종류의 primary antibody를 동시에 사용할 때는 각 secondary antibody가 원하는 primary antibody만 선택적으로 인식하도록 panel을 구성해야 합니다.

특히 mammalian tissue에서는 endogenous immunoglobulin이나 Fc receptor와의 interaction이 비특이적 background의 원인이 될 수 있습니다.

이런 상황에서 다른 mammalian antibody와 phylogenetically 거리가 있는 Chicken IgY를 primary antibody host로 활용하면 multiplex panel 설계를 보다 단순화할 수 있습니다.

Chicken IgY가 Multiplex Imaging에서 유용한 이유

① Mammalian Fc receptor와의 interaction 최소화
Chicken IgY는 mammalian IgG와 구조적으로 다르기 때문에 Fc receptor-mediated background를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.

② Mouse · Rabbit Antibody와 구분하기 쉬움
Anti-chicken secondary antibody를 사용하면 기존 mouse 또는 rabbit primary antibody와 별도의 detection channel을 구성할 수 있습니다.

③ Multiplex Panel 확장
이미 mouse와 rabbit host를 사용하고 있는 panel에 chicken이라는 새로운 host species를 추가할 수 있습니다.

④ Fluorescent Protein Signal Amplification
Fixation이나 tissue processing 이후 native fluorescence가 약해진 경우 anti-fluorescent protein antibody를 이용하여 reporter signal을 증폭할 수 있습니다.

왜 Fluorescent Protein에도 Antibody를 사용할까요?

GFP, mNeonGreen, mCherry와 같은 fluorescent protein은 자체 fluorescence를 가지고 있기 때문에 antibody 없이도 관찰할 수 있습니다.

하지만 실제 조직 연구에서는 fixation, sectioning 및 sample preparation 과정에서 native fluorescent signal이 약해질 수 있습니다.

또한 reporter expression이 낮은 knock-in model이나 weak promoter system에서는 직접 fluorescence만으로 충분한 signal을 확보하기 어려울 수 있습니다.

이때 fluorescent protein-specific antibody를 사용하면 secondary antibody detection을 통해 signal amplification이 가능합니다.

mNeonGreen & ZsGreen Chicken IgY Antibodies

Antibodies Incorporated / Aves Labs에서는 새로운 chicken polyclonal antibody 두 종류를 fluorescent protein detection portfolio에 추가했습니다.

mNeonGreen · ZsGreen · GFP는 같은 Green Reporter일까요?

모두 green spectrum에서 사용되는 fluorescent reporter지만 구조와 특성이 동일하지는 않습니다.

Multiplex IF Panel을 설계할 때 확인할 것

✓ 각 primary antibody의 host species가 겹치지 않는가?

✓ Secondary antibody 사이에 cross-reactivity가 없는가?

✓ Tissue에 Fc receptor가 많이 발현되는가?

✓ Reporter의 native fluorescence가 fixation 후에도 충분한가?

✓ Fluorophore emission spectrum이 서로 충분히 분리되는가?

✓ Low-expression reporter는 antibody amplification이 필요한가?

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