Multiplex qPCR의 성능을 좌우하는 5가지 요소
Primer부터 Fluorescent Dye까지

하나의 reaction에서 여러 target을 동시에 검출할 수 있는 Multiplex qPCR. Sample과 reagent를 절약하고 throughput을 높일 수 있지만, target 수가 증가할수록 assay 설계와 최적화는 훨씬 중요해집니다.

왜 Multiplex qPCR은 더 까다로울까요?

Singleplex qPCR에서는 하나의 target에 맞춰 primer, probe 및 reaction condition을 최적화할 수 있습니다.

반면 Multiplex qPCR에서는 여러 target이 동일한 reaction 안에서 동시에 증폭되기 때문에 primer와 probe뿐 아니라 polymerase, dNTP 등의 reaction component를 서로 공유하게 됩니다.

따라서 한 target의 amplification이 지나치게 우세하면 낮은 abundance의 다른 target 검출에 영향을 줄 수 있습니다.

① Primer & Probe Design

Target 수가 증가할수록 primer와 probe 사이에서 예상하지 못한 interaction이 발생할 가능성도 증가합니다.

Primer-dimer와 non-specific amplification을 최소화하고, 각 target의 primer가 비슷한 조건에서 효율적으로 작동하도록 설계해야 합니다.

② Target 간 Amplification Balance

Multiplex assay에서는 각 target의 abundance가 크게 다를 수 있습니다.

High-abundance target이 먼저 강하게 증폭되면 reaction component를 많이 소비하여 low-abundance target의 amplification을 억제할 수 있습니다.

따라서 필요에 따라 primer concentration을 조절하여 각 target의 amplification balance를 최적화해야 합니다.

③ Fluorescent Dye Selection

Probe-based Multiplex qPCR에서는 각각의 target을 서로 다른 reporter dye로 구분합니다.

따라서 사용하는 real-time PCR instrument의 detection channel과 reporter dye의 excitation/emission spectrum을 함께 확인해야 합니다.

특히 emission spectrum이 지나치게 겹치는 dye를 선택하면 channel 간 cross-talk가 증가하여 signal separation이 어려워질 수 있습니다.

④ Master Mix의 Multiplex Compatibility

Multiplex reaction에서는 여러 amplification reaction이 동일한 polymerase와 reaction component를 공유합니다.

따라서 높은 plex level에서도 amplification efficiency와 sensitivity를 유지할 수 있도록 Multiplex qPCR에 적합한 reaction chemistry를 선택하는 것이 중요합니다.

⑤ Low Copy Number에서의 성능 검증

높은 concentration에서 모든 target이 잘 증폭된다고 해서 Multiplex assay가 충분히 최적화되었다고 볼 수는 없습니다.

Serial dilution을 이용하여 template concentration을 낮추면서 각 target의 Ct 변화, amplification efficiency, linearity 및 reproducibility를 확인하는 과정이 중요합니다.

특히 실제 연구에서 low-abundance target을 검출해야 한다면 낮은 copy number에서 sensitivity가 유지되는지 반드시 확인해야 합니다.

Multiplex qPCR 최적화 체크리스트

✓ 각 primer/probe set을 Singleplex에서 먼저 검증했는가?

✓ Primer-dimer 및 non-specific amplification 가능성을 확인했는가?

✓ 각 reporter dye가 장비의 detection channel과 호환되는가?

✓ Dye 간 spectral overlap이 충분히 낮은가?

✓ High- / Low-abundance target 간 amplification balance를 확인했는가?

✓ Serial dilution에서 amplification efficiency와 linearity를 확인했는가?

✓ Low copy number에서도 재현성 있는 검출이 가능한가?

Multiplex qPCR Assay를 준비하고 계신가요?

알앤디메이트에서는 다양한 제조사의 qPCR Master Mix, Primer & Probe, Fluorescent Dye, Oligonucleotide 및 Molecular Biology reagent를 통합하여 구매할 수 있습니다.

찾고 계신 제품명이나 제조사, Catalog Number를 알려주시면 국내외 공급처를 확인하여 견적을 안내해 드립니다.